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Western Blot

簡要描述₪◕₪:一個基因表達終極結果是產生相應的蛋白質(或酶)✘◕│。因此檢測蛋白質是測定基因表達的主要標誌☁↟·••,檢測蛋白質的方法很多☁↟·••,除ELISA法外☁↟·••,也可用與檢測DNA和RNA相類似的吸印方法✘◕│。前兩法有“南”和“北”之意☁↟·••,故本法遂被延伸稱為Western(西)印跡法☁↟·••,該法能用SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分辨出與專一抗血清結合的專一性蛋白質✘◕│。

  • 更新時間₪◕₪:2022-09-08 00:00:00
  • 訪  問  量₪◕₪:2288

詳細介紹

樣品準備

組織樣品₪◕₪:

將組織剪成細小的碎片☁↟·••,按每20mg組織加入150-250μl裂解液的比例加入裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑)☁↟·••,勻漿器勻漿直至完全裂解✘◕│。裂解後的樣品4℃ 12000g 離心15分鐘☁↟·••,取上清☁↟·••,進行蛋白質定量後貯存於-80℃冰箱✘◕│。

1.蛋白定量;

2. 根據樣品數量☁↟·••,將BCA試劑A與試劑B按體積比為50:1配製適量BCA工作液☁↟·••,充分混勻;

3. 各孔加入160μl BCA工作液;

4. 把酶標板放在振盪器上振盪30sec☁↟·••,37℃放置30分鐘☁↟·••,然後在562nm下測定吸光度✘◕│。以吸光值為橫座標☁↟·••,蛋白濃度(μg/μl)為縱座標☁↟·••,繪出標準曲線;

5. 在酶標板中加入2μl待測蛋白和18μl PBS(稀釋10倍)☁↟·••,加入160μl BCA工作液☁↟·••,把酶標板放在振盪器上振盪30sec☁↟·••,37℃放置30分鐘☁↟·••,然後在562nm下測定吸光度✘◕│。

6. 根據所測樣品的吸光值☁↟·••,在標準曲線上即可查得相應的蛋白濃度(μg/μl)☁↟·••,乘以樣品稀釋倍數(10)即為樣品實際濃度(單位₪◕₪:μg /μl)✘◕│。

PAGE膠的製備

1. 下層分離膠的製備

    根據目的蛋白的分子量選擇不同的凝膠濃度☁↟·••,高分子量蛋白用低濃度膠☁↟·••,低分子量蛋白用高濃度膠分離✘◕│。   P62 60kDa   LC3B 14☁↟·••,16kDa  GAPDH  37kDa   故選用  10%  和15%  的膠✘◕│。   不同濃度的分離膠按下表進行配製☁↟·••,待下層膠凝固後進行上次濃縮膠的配製✘◕│。

2. 上層濃縮膠的配製

根據需要按下表配製濃縮膠☁↟·••,並插好梳子✘◕│。

上樣及電泳

1. 上樣

每孔上樣量約為       15    μl蛋白☁↟·••,可以根據實驗要求加大上樣量✘◕│。根據蛋白定量結果取所需蛋白加入適量上樣緩衝液☁↟·••,沸水浴10min後離心取上清上樣✘◕│。將配製好的PAGE膠放入電泳槽中☁↟·••,加入適量電泳緩衝液☁↟·••,取下梳子用槍輕輕吹打加樣孔☁↟·••,避免孔內有餘膠殘留影響上樣✘◕│。將準備好的樣品用加樣槍慢慢加到對應的孔內☁↟·••,注意勿溢位加樣孔✘◕│。

2. 電泳

一般濃縮膠80V 20分鐘☁↟·••,分離膠120V 60分鐘☁↟·••,可以根據具體實驗要求調整電壓和時間✘◕│。當染料到達膠底部時切斷電源☁↟·••,停止電泳☁↟·••,進行下一步轉膜✘◕│。

轉膜

轉膜分為溼轉和半乾轉☁↟·••,本實驗室選用半乾轉✘◕│。    

半乾式轉膜中☁↟·••,三明治的排列為₪◕₪:/慮紙/膠/膜/慮紙☁↟·••,用電轉緩衝液浸溼後☁↟·••,直接置於電轉儀的正負極之間✘◕│。膠於負極而膜置於正極✘◕│。半乾式的電轉緩衝液不同於溼式的電轉緩衝液☁↟·••,推薦為₪◕₪:48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇✘◕│。25V轉膜30分鐘即可✘◕│。轉膜前將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2 分鐘(NC膜在電轉液中浸泡10-20分鐘)☁↟·••,再孵育於冰冷的電轉緩衝液中5 分鐘☁↟·••,膠也需在冰冷的電轉緩衝液中平衡3-5 分鐘☁↟·••,否則轉膜時會導致條帶變形✘◕│。

膜上蛋白的檢測

    為檢測轉膜是否成功☁↟·••,可用麗春紅染色☁↟·••,麗春紅染色工作液₪◕₪:2%的麗春紅貯備液1₪◕₪:10 稀釋☁↟·••,即加9 倍的ddH2O

染色方法₪◕₪:將膜放入TBST 洗一次☁↟·••,再置於麗春紅染色工作液中,在室溫下搖動染色5 分鐘☁↟·••,大量的水洗膜直至水變清無色蛋白條帶清晰☁↟·••,(膜也可以用TBST 或水重新洗後再進行染色)PVDF 膜需用甲醇再活化後用TBST洗後進行封閉✘◕│。

膜的封閉及抗體孵育

1. 封閉₪◕₪:5%脫脂奶粉(檢測磷酸化蛋白用BSA)室溫封閉1小時或4℃過夜✘◕│。

2. 一抗₪◕₪:根據說明書   P62 1₪◕₪:1000  LC3B 1₪◕₪:1000    GAPDH 1₪◕₪:2000  稀釋抗體☁↟·••,抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度☁↟·••,和膜室溫孵育2小時或4 ℃孵育過夜✘◕│。

3. 二抗₪◕₪:孵育一抗的膜用TBST洗滌3次☁↟·••,每次5min✘◕│。隨後根據用量☁↟·••,按照1:1000稀釋HRP標記的二抗☁↟·••,與膜37℃孵育1h✘◕│。用TBST洗滌3次☁↟·••,每次5min✘◕│。

顯色

ECL化學發光檢測₪◕₪:配製ECL發光液☁↟·••,根據用量☁↟·••,取ECL發光液A和B等量混勻☁↟·••,加在膜的正面暗室避光5分鐘✘◕│。倒掉顯色液☁↟·••,用紙小心吸取顯色液☁↟·••,在上面蓋上一層平整的透明紙✘◕│。將其放入成像系統中進行掃描✘◕│。可以根據條帶強弱再次感光或減短感光時間已達到理想結果✘◕│。

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