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分子克隆與載體構建

簡要描述☁│↟↟·:DNA片段的克隆需要合適的載體↟₪▩☁╃,載體或是質粒↟₪▩☁╃,或是噬菌體↟₪▩☁╃,或是病毒↟₪▩☁╃,通常大多經過人工改造•│╃╃。作為載體必須具備兩條件☁│↟↟·:一是該載體在細胞內必須能自主複製↟₪▩☁╃,即必須具備複製原點;二是該載體必須具備適合的酶切位點↟₪▩☁╃,且這些酶切位點不在複製原點區域內•│╃╃。以上兩條↟₪▩☁╃,保證了載體的可繁殖性和可利用性•│╃╃。為了便於獲得陽隆克隆↟₪▩☁╃,載體上常有篩選標記↟₪▩☁╃,如對抗菌素的抗性↟₪▩☁╃,某些基因產物的顯色反應等•│╃╃。

  • 更新時間☁│↟↟·:2022-09-08 00:00:00
  • 訪  問  量☁│↟↟·:2337

詳細介紹

一☁₪✘、分子克隆與質粒載體構建實驗Molecular cloning 服務介紹

分子克隆是在分子水平上提供一種純化和擴增特定DNA片段的方法•│╃╃。常含有目的基因↟₪▩☁╃,用體外重組方法將它們插入克隆載體↟₪▩☁╃,形成重組克隆載體↟₪▩☁╃,透過轉化與轉導的方式↟₪▩☁╃,引入適合的寄主體內得到複製與擴增↟₪▩☁╃,然後再從篩選的寄主細胞內分離提純所需的克隆載體↟₪▩☁╃,可以得到插入DNA的許多複製↟₪▩☁╃,從而獲得目的基因的擴增•│╃╃。

二☁₪✘、分子克隆與質粒載體構建實驗Molecular cloning 實驗原理

外源DNA與載體分子的連線就是DNA重組↟₪▩☁╃,這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子•│╃╃。重組的DNA分子是在DNA連線酶的作用下,有Mg2%2B☁₪✘、ATP存在的連線緩衝系統中↟₪▩☁╃,將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連線•│╃╃。DNA連線酶有兩種☁│↟↟·:T4噬菌體DNA連線酶和大腸桿菌DNA連線酶•│╃╃。兩種DNA連線酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能↟₪▩☁╃,而且T4噬菌體DNA連線酶還有—種大腸桿菌連線酶沒有的特性↟₪▩☁╃,即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連線起來•│╃╃。但這種連線的效率比粘性末端的連線效率低↟₪▩☁╃,一般可透過提高T4噬菌體DNA連線酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連線效率•│╃╃。

    T4噬菌體DNA連線酶催化DNA連線反應分為3步☁│↟↟·:先↟₪▩☁╃,T4DNA連線酶與輔助因子ATP形成酶—AMP複合物;然後↟₪▩☁╃,酶—AMP複合物再結合到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上↟₪▩☁╃,使DNA腺苷化;後產生一個新的磷酸二酯鍵↟₪▩☁╃,把切口封起來•│╃╃。

    DNA重組的方法主要有粘端連線法和平端連線法↟₪▩☁╃,為了防止載體本身的自連↟₪▩☁╃,可以透過(牛小腸鹼性磷酸酶)CIP處理克服•│╃╃。

    連線反應的溫度在37℃時有利於連線酶的活性.但是在這個溫度下↟₪▩☁╃,粘性末端的氫鍵結合是不穩定的•│╃╃。因此人們找到了一個折中溫度↟₪▩☁╃,即12-16℃↟₪▩☁╃,連線12-16h(過夜)↟₪▩☁╃,這樣既可大限度地發揮連線酶的活性↟₪▩☁╃,又兼顧到短暫配對結構的穩定•│╃╃。

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