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過表達慢病毒構建

簡要描述·✘•◕✘:慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎發展起來的病毒載體▩₪│☁✘。對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力╃₪✘│₪,可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上╃₪✘│₪,從而達到永續性表達▩₪│☁✘。在體外實驗及體內實驗的研究中╃₪✘│₪,慢病毒己經成為表達外源基因或外源shRNA的常用載體形式之一╃₪✘│₪, 並且正在獲得越來越廣泛的應用▩₪│☁✘。

  • 更新時間·✘•◕✘:2022-09-08 00:00:00
  • 訪  問  量·✘•◕✘:2209

詳細介紹

實驗流程·✘•◕✘:

利用限制性內切酶消化獲得線性化載體▩₪│☁✘。PCR 擴增製備目的基因片段▩₪│☁✘。所用擴增引物在設計時需在其5'端新增同源重組序列(圖中以綠色和藍色標記)╃₪✘│₪,使用該引物擴增目的基因片段╃₪✘│₪,擴增產物5'和3'最末端的序列分別與線性化克隆載體兩末端序列完全一致▩₪│☁✘。以線性化載體和目的基因擴增產物配製反應體系╃₪✘│₪,進行重組反應,實現線性化載體和目的基因片段的體外環化▩₪│☁✘。重組產物直接進行轉化╃₪✘│₪,挑取平板上的單克隆進行PCR鑑定,對陽性克隆進行測序及結果分析▩₪│☁✘。將正確克隆菌液打大培養╃✘、抽提,獲得高純度質粒,用於後續實驗▩₪│☁✘。
 

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