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PCR反應混合物的分子實驗檢測步驟介紹

釋出時間│✘│:2022-09-08 00:00:00       點選次數│✘│:2053

  進行分子實驗檢測時需要先準備PCR反應混合物│✘│:根據DNA樣本的數量來確定除了DNA外其他混合物的體積(額外增加一份來確保有足夠的PCR反應混合物)↟✘•▩•,將擴增每一個遺傳標記並且在每一個PCR反應管內分19.5uL的反應混合物↟☁▩☁·。
  配製膠溶液│✘│:將25g尿素◕₪✘•↟、7.5mL40%丙烯醯胺│✘│:PDA(19:1)加入到250mL的錐形瓶中↟☁▩☁·。加蒸餾水至50mL↟✘•▩•,充分混勻來溶解尿素(見註釋4)↟☁▩☁·。
  準備制膠板│✘│:把膠板洗乾淨↟✘•▩•,確保上面沒有灰塵↟✘•▩•,用矽化玻璃板↟☁▩☁·。根據各個廠家的不同把玻璃板夾在一起並且用膠條封住底部(這一過程根據裝置的不同而有所變化)↟☁▩☁·。
  如果不用帶有加熱蓋的PCR儀↟✘•▩•,那麼就需要在每個管子的頂部加入礦物油來防止液體蒸發↟☁▩☁·。
  進行分子實驗檢測時在每個管子中加0.5的DNA樣本↟☁▩☁·。
  把管子放在PCR儀中↟✘•▩•,95℃加熱3min變性DNA↟☁▩☁·。
  95℃變性40s◕₪✘•↟、55℃引物退火40s◕₪✘•↟、72℃延伸40s↟✘•▩•,迴圈30-35次↟☁▩☁·。
  把PCR產物和尿素上樣緩衝液1:1混合.
  加入500uL10%的過硫酸銨到膠混合液中並且透過濾紙過濾↟☁▩☁·。
  取出10mL膠溶液加入到一個小燒杯中並且加10~15↟☁▩☁·。馬上將膠倒到板上↟☁▩☁·。幾分鐘之內膠將聚合到一起↟✘•▩•,封玻璃板的底部↟☁▩☁·。
  封好膠後↟✘•▩•,加15ul到剩餘的膠溶液中並且馬上把膠倒到兩塊膠板之間↟☁▩☁·。仔細插入膠梳子↟✘•▩•,讓膠聚合2h至過夜↟☁▩☁·。
  取下膠底部的封條↟☁▩☁·。把膠放在電泳槽中確保電極插入的方向正確↟☁▩☁·。將膠槽中灌滿(大約1.5L↟✘•▩•,根據裝置的不同量有所不同)↟☁▩☁·。拔掉膠梳子↟✘•▩•,沖洗上樣孔↟☁▩☁·。
  把膠預熱60min直到溫度在50℃左右↟☁▩☁·。
  在上樣之前再次用加樣器沖洗上樣孔↟☁▩☁·。在每個孔中加產物和上樣染料(上樣量根據梳子的大小和PCR產物的濃度而不同)↟☁▩☁·。根據產物片段大小的不同跑膠時間可以從30min到3h之間變化↟☁▩☁·。

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